Tha an ìre de purity pròtain a dhìth an urra ris a 'chleachdadh deireannach a thathar a' sùileachadh a thaobh a 'phròtain.
Airson cuid de thagraidhean, tha earrann amh gu leòr. Ach, airson feuman eile, mar ann am biadh agus leigheasan, tha ìre àrd de ghlanachd riatanach. Gus seo a choileanadh, bidh iomadh dòigh purchaidh pròtain air a chleachdadh gu h-àbhaisteach, ann an sreath de cheumannan glanaidh.
Mar as trice bidh a h-uile ceum puridh pròtain a 'toirt a-mach cuid de chall toraidh. Mar sin, is e ro-innleachd fìor-ghlanadh pròtain a th 'ann an aon dòigh anns an ruigear an ìre as àirde de ghlanadh anns na ceumannan as lugha. Tha an taghadh de na ceumannan gu feum an urra ri meud, cosgais, sùbailteachd agus seilbh eile a 'phròtain targaid. Tha na dòighean a leanas as freagarraiche airson aon phròtain ceosostach a ghlanadh. Tha a bhith a 'fuasgladh fhilltean pròtain cytosolaich nas duilghe agus mar as trice feumar diofar dhòighean a chur an gnìomh.
A 'chiad Steps airson Purification Protein
Is e a 'chiad cheum ann am pròtainnean intracellular (taobh a-staigh na cealla) a ghlanadh a bhith ag ullachadh earbadh amh .
Anns an earrainn bidh measgachadh iom-fhillte de na protainnean gu lèir bhon cytoplasm cealla, agus cuid de mhacromolecules, cofactaran agus mathachaidh a bharrachd. Faodar an earrann mì-laghail a chleachdadh airson cuid de thagraidhean ann an bith-theicneòlas, ge-tà, ma tha purity na chùis, feumar leantainn air ceumannan purchaidh an dèidh sin.
Bidh earrannan pròis amh air an ullachadh le bhith a 'toirt air falbh sprùilleach cealla air an cruthachadh le lysis cealla, a tha air a choileanadh le bhith a' cleachdadh cheimigean agus enzymes , sonication no Press French. Thèid an sprùilleach a thoirt air falbh le bhith a 'toirt air falbh, agus thèid an stuth a tha a' fàs nas slaodaiche fhaighinn air ais. Is dòcha gun tèid ullachaidhean amh de phrotainnean extracellular fhaighinn le bhith a 'toirt air falbh nan ceallan le bhith a' toirt a-mach crìonadh.
Airson cuid de dh 'iarrtasan bith-theicneòlais , tha iarrtas ann airson enzyman thermostable : einnseanan a dh'fhaodas teothachd àrd a ghabhail a-steach gun a bhith a' toirt air falbh, agus fhad 'sa tha iad a' cumail gnìomhachd àrd sònraichte. Bidh uaireannan a tha gan cruthachadh uaireannan air an ainmeachadh extremophiles. Is e dòigh furasta a th 'ann airson a bhith a' glanadh pròtain teas a dh 'aindeas na pròtaininean eile anns a' mheasgachadh le teasachadh, agus an fhuasgladh a fhuarachadh (mar sin a 'leigeil leis an einnsean thermostable ath-leasachadh no ath-dhìoladh, ma bhios sin riatanach).
Ceumannan Measaidh Eadar-mheadhanach
San àm a dh'fhalbh, b 'e an dàrna ceum cumanta a bhith a' purgachadh pròtain bho earrann amh le fuasgladh ann am fuasgladh le neart àrd osmotic (ie fuasglaidhean salainn). Faodar achaidhean niuclasach san earrann amh a thoirt air falbh le bhith a 'toirt air falbh cho-chruinneachaidhean air an cruthachadh le streptomycin sulfate no protamine sulfate.
Mar as trice thathar a 'dèanamh deiseadh protein a' cleachdadh ammonium sulfate mar an salann.
Bidh diofar phrotain a 'tiormachadh ann an diofar cho-chruinneachaidhean de ammonium sulfate . Anns an fharsaingeachd, tha proteinan de dhorasachadh cuideam nas àirde ann an cuideam nas ìsle de ammonium sulfate. Mar as trice cha bhi fuasgladh salann a 'leantainn gu pròtain a tha air a dhearbhadh gu mòr ach faodaidh e cuideachadh le bhith a' cur às do chuid de na pròtainean nach eil ag iarraidh ann am measgachadh agus a 'cuimseachadh air an sampall. Bidh salainn anns an fhuasgladh air an toirt air falbh le dialysis tro thubaid ceallalose porous, fiolmadh, no cromatagrafaidhean às-dùnadh gel.
Bidh protocolaidhean bith-eòlach nuadh gu tric a 'gabhail brath air an uidheamachd a tha ri fhaotainn gu malairteach a tha a' toirt seachad fuasglaidhean deiseil airson modhan àbhaisteach. Bidh purrachadh crùin air a dhèanamh gu tric le bhith a 'cleachdadh sgilearan agus a' deasachadh colbhan fiodha gel. Chan eil agad ri dhèanamh ach lean an stiùireadh agus cuir ris an tomhas ceart den fhuasgladh cheart agus feitheamh ris an ùine shònraichte fhad 'sa tha thu a' cruinneachadh an t-sruthain (dè tha a 'tighinn a-mach air ceann eile a' cholbh) ann an tube deuchainn ùr.
- Faodar dòighean cromatagrafaidheachd a chur an sàs a 'cleachdadh colbhan mullaich-mullaich no uidheam fèin-ghluasadach HPLC. Faodar sgaradh le HPLC a dhèanamh tro dhòighean cùil-iomlaid, iomlaid-ion no meud-meud, agus samples a chaidh a lorg le raon diofraichte no teicneòlas laser. Deer
Lèirmheas Pròinein agus Measadh Dealachaidh
- Tha cromatagraf ceum-reverse (RPC) a 'sgaradh phròtainean stèidhichte air an hydrophobicities co-cheangailte. Tha an dòigh seo gu math roghnach ach feumar a bhith a 'cleachdadh solventan organach. Tha cuid de phrotainnean gan sàrachadh fad na h-ùine le luchd-turais agus caillidh iad dleastanas rè RPC. Mar sin chan eil am modh seo air a mholadh airson gach tagradh, gu h-àraid ma tha e riatanach gum bi am pròtain targaid gnìomhachd a chumail.
- Tha cromatography ion-iomlaid a ' toirt iomradh air sgaradh phrotainin stèidhichte air cosgais . Faodar colbhan a bhith air an ullachadh airson iomlaid anion no iomlaid cation. Tha colbhan iomlaid aig Anion a ' gabhail a-steach ìre stadach le cosgais mhath a bhios a' tàladh phrotainnean le droch dhìol. Is e colbhan iomlaid còiridh a 'chùl, gràineagan a tha air an cur an sàs gu h-àicheil a tha a' tàladh phrotain. Thathas a 'dèanamh dòrtadh air a' phròt (s) targaid le bhith ag atharrachadh pH sa cholbh, a tha a 'ciallachadh gu bheil atharrachaidhean no neadanachadh de bhuidhnean gnìomhach a tha air am pàigheadh airson gach pròtain.
- Tha cromatagrafaidhean mead-dùnadh ( sgaradh gèel ) a 'sgaradh phrotainidean nas motha bho fheadhainn bheaga bho tha na molecoli nas motha a' siubhal nas luaithe tron phoileymair tar-cheangailte anns a 'cholbh chromatagrafaidheachd. Chan eil na pròtaidean mòra a 'tighinn a-steach do phòlaichean a' pholaimir ach bidh proteinnichean nas lugha a 'dèanamh, agus gabhaidh iad nas fhaide airson siubhal tron cholbh chromatagrafaidheachd, tron slighe nach eil cho dìreach. Tha Eluate air a chruinneachadh ann an sreath de thiùban a 'sgaradh phrotainnean stèidhichte air àm elution. Tha flèanadh gèine feumail airson a bhith a 'cuimseachadh sampall pròtain bho tha am pròtain targaid air a chruinneachadh ann an tomhas nas lugha na chaidh a chur ris a' cholbh an toiseach. Dh'fhaodadh dòighean sìolachaidh coltach a bhith air an cleachdadh nuair a thathar a 'dèanamh phròtain mòr air sgàth prìsean èifeachdais.
- Tha cromatagrafaidheachd càirdeas na dhòigh feumail airson "a bhith a 'poliseadh" no a' crìochnachadh pròiseas purchaidh pròtain. Tha gràineagan anns a 'cholbh chromatography air an ceangal ri ligands a tha a' ceangal gu sònraichte ris a 'phròtain targaid. Tha am pròtain an uair sin air a thoirt bhon cholbh le bhith a 'sruthadh le fuasgladh anns a bheil ligands an-asgaidh. Tha an dòigh seo a 'toirt seachad toraidhean as fhìor-ghlan agus an gnìomhachd as àirde a tha coimeasach ri dòighean eile.
- Is e SDS-PAGE electrophoresis gel polyacrylamide, a tha air a dhèanamh an làthair SDS (dodecyl sulfate sodium) a tha a 'ceangal ri protainin a bheir dhaibh cuibhreann mòr àicheil. Leis gu bheil na cosgaisean uile de na protaidean cothromach co-ionann, tha an dòigh seo gan sgaradh gu ìre mhòr cha mhòr stèidhichte air meud. Tha SDS-PAGE gu tric air a chleachdadh gus dearbhadh purity pròtain às deidh gach ceum ann an sreath. Mar a thèid pròtainnean neo-thaghadh a thoirt air falbh mean air mhean bhon mheasgachadh, tha an àireamh de chòmhlain air an sealltainn air gel SDS-PAGE air a lùghdachadh, gus nach eil ach aon chòmhlan a 'riochdachadh a' phròtain a tha a dhìth.
- Is e immunoblotting am modh dearbhaidh pròtain a thathar a 'cleachdadh còmhla ri cromatography affinity. Tha antibodies airson pròtain sònraichte air an cleachdadh mar ligands air colbh cromatography affinity. Tha am pròtain targaid air a ghleidheadh air a 'cholbh, agus an uairsin air a thoirt air falbh le bhith a' sruthadh a 'cholbh le fuasgladh salainn no àidseantan eile. Tha antibodies ceangailte ri cuideachadh lèinean rèidio-beòil no dath ann a bhith a 'lorg a' phròtain targaid nuair a thèid a sgaradh bhon chòrr den mheasgachadh.
Stòran:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co, New York, NY, na SA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Leabhar-làimhe Purification Purification, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, na SA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.