Dè a dh'fheumas PCR a dhèanamh le bhith a 'leantainn DNA agus a' leudachadh ginean
Is e modh ginealachd mholaileil a th 'ann an imrich slat polymerase ( PCR ) airson iomadh leth-bhreac de ghine a dhèanamh agus cuideachd mar phàirt den phròiseas òrdachadh gine.
Ciamar a tha Atharrachadh-slabhraidh Polymerase ag obair?
Tha leth-bhreacan gine gan dèanamh a 'cleachdadh sampall de DNA, agus tha an teicneòlas math gu leòr airson iomadh lethbhreac a dhèanamh bho aon chopal den ghine a gheibhear anns an sampall. Leudaich PCR de ghine airson milleanan de leth-bhreacan a dhèanamh, a 'ceadachadh sreathan gine a lorg agus a chomharrachadh a' cleachdadh dhòighean lèirsinneach stèidhichte air meud agus cosgais (+ no -) den phìos DNA.
Fo chumhachan fo smachd, tha earrannan beaga de DNA air an cruthachadh le einnseanan ris an canar DNA polymerases, a tha a 'cur ri deoxynucleotides (dNTPs) gu pìos DNA ris an canar "teamplaid." Thathas a 'cleachdadh fiù' s pìosan beaga de DNA, ris an canar "primers" mar thoiseach tòiseachaidh airson an polymerase. Is e pìosan beaga de DNA (oligomers) a th 'ann an cinneagan, mar as trice eadar 15 agus 30 nucleotides a dh'fhaid. Tha iad air an dèanamh le bhith a 'tuigsinn no a' breithneachadh shreathan DNA goirid aig fìor chrìochan na gine a tha air am meudachadh. Rè PCR, thèid an DNA a thionndadh a theasachadh agus na sreathan dùbailte air leth. Nuair a bhios iad a 'fuarachadh, bidh na ciad-cheangail a' ceangal ris an teamplaid (ris an canar annealing) agus cruthaich àite airson an polymerase tòiseachadh.
An Technic PCR
Chaidh ath-sgrùdadh slabhraidh polymerase (PCR) a dhèanamh comasach le bhith a 'lorg thermophiles agus einnseanan polymerase thermophilic (enzymes a tha a' cumail suas ionracas structair agus gnìomhachd an dèidh teasachadh aig teòthachd àrd).
Tha na ceumannan a tha an lùib a 'phoileasaidh PCR mar a leanas:
- Tha measgachadh air a chruthachadh, le co-chruinneachaidhean as fheàrr den teamplaid DNA, enzym polymerase, primers, agus dNTPs. Tha an comas a bhith a 'teasachadh a' mheasgachaidh gun a bhith a 'toirt an àichealachd air a dhì-fhàs a' ceadachadh an helics dùbailte de shampall DNA a dhì-sheasamh aig teòthachd anns an raon de 94 ceum Celsius.
- Às dèidh dìth-àrachais, tha an sampall air a fhrithealadh gu raon nas meadhanach, timcheall air 54 ceum, a tha a 'toirt cothrom do na teamplaidean DNA aon-sreathach (ceangail) a thoirt air falbh.
- Anns an treas ceum den chuairt, tha an sampall air ath-ùrachadh gu 72 ceum, an teòthachd freagarrach airson Taq DNA Polymerase, airson fadachadh. Le bhith a 'dol am meud, bidh DNA polymerase a' cleachdadh an aon shreath thùsail de DNA mar theamplaid gus dNTPan co-phàirteach a chur ri 3 'ceann gach primer agus a' cruthachadh earrann de DNA dùbailte anns an roinn gine de dh 'ùidh.
- Chan eil ceumannan a tha air an ceangal ri sreathan DNA nach eil cho sìmplidh a 'fuireach aig 72 ceum, agus mar sin a' cuingealachadh leudachadh air an gine inntinneach.
Bidh am pròiseas seo de dhì-sheasamh, deisealachadh agus dealachadh a 'nochdadh iomadh uair (30-40), agus mar sin a' meudachadh gu h-obrachail an àireamh de chopaidhean den ghine a tha a dhìth anns a 'mheasgachadh. Ged a bhiodh am pròiseas seo gu math tinnmhor ma thèid a dhèanamh le làimh, faodar sgaoilidhean a dheisealachadh agus a ghiùlan ann an Thermocycler a tha clàraichte, a tha a-nis cumanta anns a 'chuid as motha de na h-obraichean molecular, agus faodar freagairt PCR slàn a dhèanamh ann an 3-4 uairean.
Bidh gach ceum dì-sheasmhach a 'stad air pròiseas leudachadh a' chuairt roimhe, mar sin a 'cuartachadh sreathan ùr DNA agus ga chumail gu mu mheud na gine a tha a dhìth.
Faodar fad a 'chuairt fadachaidh a dhèanamh nas fhaide no nas giorra a rèir meud an gine de ùidh, ach sa cheann thall, tro chuairtichean ath-chuairteachaidh PCR, bidh a' mhòr-chuid de na teamplaidean air an cuingealachadh ri meud an gine de ùidh a-mhàin, mar a tha iad a bhith air a ghineadh bho stuthan an dà chuid de na prìomhairean.
Tha grunn nithean ann airson PCR soirbheachail a dh'fhaodas a bhith air an làimhseachadh gus na toraidhean a neartachadh. Is e an dòigh as motha a chleachdar airson deuchainn airson làthaireachd PCR a th 'ann an electrophoresis gel agarose . A tha air a chleachdadh gus pìosan DNA a sgaradh a rèir meud agus cosgais. Tha na pìosan air an dealbhadh an uairsin a 'cleachdadh dathan no radioisotopes.
An Evolution
Bho chaidh PCR a lorg, chaidh polymerases DNA a bharrachd air an Taq tùsail a lorg. Tha comas nas fheàrr aig cuid dhiubh sin comasach air "dearbhadh" no tha iad nas seasmhaiche aig teothachd nas àirde, le sin a 'leasachadh sònrachas PCR agus mearachdan a lughdachadh bho bhith a' cur a-steach an dNTP mì-cheart.
Chaidh cuid de dh 'atharrachaidhean PCR a dhealbhadh airson tagraidhean sònraichte agus tha iad a-nis air an cleachdadh gu cunbhalach ann an taisbeanaidhean ginteil ghinealach. Tha cuid dhiubh sin PCR Real-Time agus PCR Reverse-Transcriptase. Tha lorg PCR cuideachd air leantainn gu leasachadh leantainneachd DNA , lorg meòir DNA agus dòighean eile molecolcach.