Faodaidh atharrachaidhean ri gin de na co-phàirtean de fhreagairt Ath-bheothachadh Polymerase Chain (PCR) atharrachadh càileachd a 'bhuil, le bhith a' leasachadh no a 'lùghdachadh toradh is càileachd toraidh no le bhith a' leasachadh an t-sònrachadh agus an cugallachd freagairt. Faodaidh tomhas-tomhais a bheir buaidh air toradh a 'chinn a bhith an dara cuid fiosaigeach (ie teòthachd, amannan rothair) no ceimigeach (ie, teamplaid cruinneachaidh, seòrsa de shiostaman). Tha na leanas grunn nithean cudromach a bheir buaidh air soirbheachas PCR.
01 Cumhaichean Lèigheadaireachd Glan
Seach gu bheil PCR comasach air aon mholacile de DNA a lorg, tha e cudromach a bhith a 'cumail suas droch shuidheachaidhean san obair-lann. Bidh miotagan ùra air an-còmhnaidh, cleachd bathar glainne, tuban agus molaidhean pìobaidh neo-fhillte, agus cleachd an raon obrach mus tòisich thu air obair.
Bidh an-còmhnaidh a 'gabhail a-steach ath-bheachdan smachd, gun teamplaid DNA agus gun einnsean, gus dèanamh cinnteach gu bheil na toraidhean gu mòr mar thoradh air leudachadh air an eisimpleir cheart.
Bidh a 'mhòr-chuid de dhaoine a' dèanamh cinnteach gu bheil an t-sreath fhuasglaidhean aca fhèin nach eil air an co-roinn gus pacaidean nas fhasa agus pipettes ainmichte a chur an dara taobh airson PCR a-mhàin. Tha diùban PCN DNase agus RNase, molaidhean pìobairean a tha a 'seasamh an aghaidh aerosol agus ag obair ann an ceòc le sùilean UV cuideachd air dòighean gus duilgheadasan a lùghdachadh.
02 Companaidhean Ceimigeach
- Bheir bunaitean 18 gu 24 agad
- Na bi structar àrd-sgoile agad (ie, lùban teann)
- Thoir seachad cothromachadh cothromach de chàraidean G / C agus A / T
- Chan eil iad a 'cur ri chèile a chèile aig na h-oisean 3-coise
- Thoir teothachd teas (Tm) mu 5-10 ceum Ceiltis fo theòthachd annealing, a tha mar as trice eadar 55 agus 65 ceum Celcius
Bu chòir gum biodh an Tm airson an dà chuid prìomhachas cuideachd coltach ris na toraidhean as fheàrr.
03 Mix Mix: Teamplaid is Primers
Tha na co-chruinneachaidhean pròiseas sùbailte eadar 0.1 agus 0.6 micromoles / L. Tha an tomhas de theamplaid ag atharrachadh a rèir an seòrsa DNA (daonna, bacterial, plasmid).
Le tomhas glè bheag de theamplaid, tha ro-innleachdan eile ann airson toraidhean a thoirt air adhart, mar àireamhan nas motha de chuairtean no cleachdadh "start teth". Deuchainnean ùr a dhearbhadh daonnan le droch bhuaidh smachd, gus a bhith cinnteach gu bheil iad ag obair fo na suidheachaidhean dearbhaidh sònraichte agad.
04 Measgachadh Reaction: Gnìomhachd Einnsein
Faodaidh an cruinneachadh de MgCl2 anns a 'mheasgachadh freagairt buaidh a thoirt air toradh PCR agus dh'fhaodadh àite cudromach a bhith aige ann an ath-bheachdan nas luaithe. Foirmichean cinneas magnesium a 'cruthachadh so-fhillte le dNTPs gus an t-substrate fìor a tha a' toirt aithne don polymerase enzym a thoirt seachad.
Bidh suimeannan co-ionann de na ceithir dNTPan cuideachd a 'cuideachadh le bhith a' lùghdachadh ìre mearachd polymerase. Faodaidh cuid de bhunaitean leithid betaine, BSA, glacairean, DMSO, glycerol, agus pyrophosphatase cuideachd buaidh a thoirt air sònraichteachd einnsein no èifeachdas freagairt.
05 Seòrsa Thermocycler
Nuair a bhios tu a 'ceannach airson uidheamachd lann-lann, cuimhnich nach eil cuid de theas-teasairginn nas mionaidiche na feadhainn eile ann a bhith a' cumail an teòthachd cheart, a tha ag iarraidh.
Is e seo aon sgìre far nach pàigh saor a phàigheadh san fhad-ùine nuair a tha thu a 'toirt aghaidh ort a bhith a' dèiligeadh ri cnàmhan no a 'cleachdadh prìomhadairean a dh' fheumas raon cumhang de theodhachd annealing.
Bidh tuban freagairt mu thimcheall le ballachan a chaidh a dhealbhadh gus a bhith a 'freagairt air a' bhratach teirm-teasairginn a tha thu a 'cleachdadh, cuideachd a' cuideachadh an teothachd freagairt as fheàrr.
06 Roghainnean air baidhsagal
Faodar meudachadh toradh a choileanadh le bhith a 'meudachadh an ùine leudachadh mu gach 20 cic, gus dìoladh nas lugha de einnseanas barrachd teamplaid a leudachadh. Mar as trice, tha nas lugha na 40 cuairtean gu leòr airson nas lugha na 10 teamplan molecolalan a mheudachadh gu ìre mhòr gu leòr airson sùil a thoirt air gel agarose le briodide eitidium .